Особенности выявления активности трансмембранных ферментов в эритроцитах и мембранных препаратах эритроцитов млекопитающих

Abstract

The article analyzes the methods of detecting the activity of transmembrane enzymes in erythrocytes and in membrane preparations of erythrocytes of mammals (including humans). A widespread method of detecting the activity of transport ATPases in whole erythrocytes with the use of Tween-20 can detect the activity of the enzyme without changing the cooperative interaction of the subunits of the Na,K-ATPase during the reaction cycle. Upon receipt of membrane preparations of erythrocytes using hypoosmotic hemolysis by the method of Dodge et.al. about 80% of the membrane preparations at their premises on environ of the enzyme activity determination are «closed», forming a latent form of the enzyme, to identify which is not possible without a mild increase in the permeability of the membrane to open access of substrate and cofactors to the active sites. The introduction of 0.5-1 mm EDTA in the environment of the hemolysis prevents the process that allows a 2-4 fold increase in detectable enzyme activity in the membrane preparations of erythrocytes. It is assumed that the membrane preparations (shadows) of erythrocytes when they are received (hemolysis of erythrocytes) in the presence of chelators of divalent ions lose the ability to «closure» as a result of loss of peripheral membrane proteins of the skeleton (most likely the speсtrin and actin).

В статье анализируются методы выявления активности трансмембранных ферментов в эритроцитах и в мембранных препаратах эритроцитов млекопитающих (в том числе человека). Широко распространенный метод выявления активности транспортных АТФаз в цельных эритроцитах с применением Твин-20 позволяет выявлять активность фермента без изменения кооперативного взаимодействия субъединиц Na, K-АТФазы в ходе реакционного цикла. При получении мембранных препаратов эритроцитов c помощью гипоосмотического гемолиза по методу Dodge et.al. примерно 80% мембранных препаратов при помещении их в среду определения ферментативной активности «замыкаются», формируя латентную форму фермента, выявить которую не представляется возможным без мягкого увеличения проницаемости мембран для открытия доступа субстрату и кофакторам к активным центрам. Внесение 0,5-1 мМ ЭДТА в среду гемолиза предотвращает этот процесс, что позволяет в 2-4 раза увеличить выявляемую активность ферментов в мембранных препаратах эритроцитов. Предполагается, что мембранные препараты (тени) эритроцитов при их получении (гемолизе эритроцитов) в присутствии хелаторов двухвалентных ионов теряют способность к «замыканию» в результате потери периферических белков мембранного скелета (скорее всего, спектрина и актина).